生物实验外包

原理MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4.5)-dimethylthiahiazo(-Z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT噻唑蓝为基础。MTT为化台物,是种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶,formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50%的N.N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH4.7)的MTT溶解液中溶解,利用酶标仪测定490nm处的光密度0D值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。MTT粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以。实验的时候一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。实验步骤1、接种细胞：用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积20ul。2、细胞培养:同一般培养条件，培养3-5天。3、呈色：培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配)20ul.继续孵育4小时，终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于基浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ulDMSO,振荡10分钟使结晶勿充分融解。4、比色：选择490nm波长,在醇联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。结果提供整体实验报告，实验原始数据、图表；IC50值；